研究發現干擾細胞內 DNA 修復機制能提升 CRISPR 效率

作者 | 發布日期 2016 年 09 月 19 日 7:15 | 分類 生物科技 follow us in feedly

CRISPR-Cas9 系統做為近年來最熱門的基因編輯技術,廣泛的在學術界被運用於研究中,能夠剔除人類細胞株中的特定基因,並以此找出該基因的功能,但這項技術有個美中不足之處,就是它剔除不同基因時的效果有很大的差異。



在 8 月 17 日發表於網路科學期刊 Nature Communications 的研究中,來自美國加州大學柏克萊分校的研究團隊找到了新方法,在各種人類細胞中能夠提升 CRISPR-Cas9 剔除(knockout)基因的效率至原先的 5 倍,使得基因剔除變得更加容易,並且有機會讓突變基因無法運作,藉此做為醫療方法。

科學家不斷地透過各種實驗技術在生物系統內發現新基因,以及他們所轉譯出的蛋白質,但真正困難的工作是,找到這些基因以及蛋白質在生物體內或疾病的形成中所扮演的角色。要找出一個基因或蛋白質的生理功能還有角色最好的辦法,就是將它從生物體內移除,看生物運作有什麼改變,藉此來抽絲剝繭找出它可能扮演的角色,最後再以其他實驗方法驗證。

自從 CRISPR 基因編輯技術出現之後,這項技術使得科學家在進行研究時,能用更短的時間就將特定的基因從細胞株中移除。在這個過程中,研究者必須要不斷地嘗試各種基因編輯工具,找到效果最好且最適合的才方便實驗的進行。由於研究中使用的穩定細胞株大多來自癌化的細胞,這些癌化細胞株的每個基因數目,通常會比一般細胞多出兩倍以上,使得基因剔除在這些穩定的癌化細胞株上的難度更高,這項技術改良將能大幅提升進行此類研究的效率。而在這項研究中,研究團隊所找到的方法能讓這個過程簡單而快速許多。

這項技術的關鍵在於將 CRISPR-Cas9 蛋白質和低聚核苷酸(oligonucleotides)一起送入細胞中,這裡用的低聚核苷酸是一種短 DNA 序列,不會和人類基因組中任何片段結合,能夠干擾細胞內的 DNA 修復機制,使 CRISPR 所進行的基因編輯效率隨之提升。

這項研究的首席研究員是身為加州大學柏克萊分校 Innovative Genomics Initiative(IGI)科學長以及分子及細胞生物學兼任助理教授的 Jacob Corn,他表示,在加強了這項技術之後,剔除特定基因變得非常容易,只要將不會和人類基因結合的合成低聚核苷酸送入細胞中,就能夠將基因修改的效率提升 5 倍之高,尤其合成的低聚核苷酸成本也不高,這樣的技術使得原先難以執行甚至根本無法成功的 CRISPR-Cas9 運用效率大幅提升。

 

提升 DNA 修復出錯的機會

一旦基因編輯效率提升,科學家們在進行需要基因剔除實驗的成功率也就隨之提升,接著就能使用剔除特定基因的細胞株進行研究,對於基因功能方面的研究有很大的助益。除了在研究技術上的運用,將這項技術用於剔除遺傳的基因突變也能有所助益。內科醫師推測特定基因的剔除,會使人們更容易患有某些如愛滋等傳染性疾病,或者更容易患有自體免疫失調、發炎症狀或者神經退化失調。雖然這方面的應用仍有待未來進一步研究,但目前這項改良技術的高效率已經對研究有許多助益。

CRISPR-Cas9 系統中,Cas9 蛋白質所扮演的角色就像一把專門裁切 DNA 的剪刀,並且根據指示在特定的位置進行截切。負責指示 Cas9 截切位置的是一種被稱為嚮導 RNA 的短 RNA 片段,大約由 20 個核苷酸分子所組成,這一小段核苷酸序列和截切的目標基因序列互補,能夠和目標 DNA 結合,再讓 Cas9 蛋白質得以靠近,並將目標基因的雙股 DNA 結構剪開。

在進行截切時,細胞內的修復系統將裁切的切口重新補起來,但是細胞內的修復系統並不是每次都能正確的運作,當修復系統出錯時,DNA 序列就會出現突變,可能造成對應的基因失去功能,進而剔除基因活性。

自從 CRISPR 技術在 2012 年被來自加州大學柏克萊分校的 Jennifer Doudna 及瑞典于默奧大學的 Emmanuelle Charpentier 發明以來,不同條件下的效率差異一直都困擾著科學家們。有些嚮導 RNA 有很好的效果,能夠幫助 Cas9 幾乎百分之百的將目標基因剔除;而有些卻正好相反,有些嚮導 RNA 剔除基因的效率非常低,甚至連和目標基因結合都有困難。除此之外,在不同細胞株中基因剔除的效率差異很大也是問題之一。

根據 Corn 的推測,Cas9 在某些狀況下剔除基因的效率較差或許和 DNA 的修復方式有關。DNA 修復相關的蛋白質在細胞中穩定的表達,能夠修正 DNA 上任何斷裂或者缺失,避免細胞因為突變而死亡。但 DNA 修復系統在每種細胞中都不盡相同,而細胞中隨機的 DNA 序列可能會擾亂修復系統,並影響成功機率,也就是說研究團隊必須得要想辦法避免細胞內的修復系統作用。

Corn 形容 CRISPR-Cas9 基因編輯技術在細胞內的作用不斷的和細胞本身的 DNA 修復機制競爭,每當 Cas9 在 DNA 上製造一個切口,細胞就會立即把切口補上,Cas9 再切一次,切口又再次被補上。這樣不斷重複的截切再修復循環,最後通常會因為修復系統終於出現錯誤,用錯誤的序列修復切口而造成突變,進而導致基因喪失原先的功能,這樣的循環才會停止。而在這項研究中加入低聚核苷酸或許就是因為它能夠干擾細胞內 DNA 修復系統的準確度,或者迫使細胞採取較容易出錯的修復機制,藉此幫助 Cas9 能夠更有效率的進行 DNA 截切。而研究團隊的下一個目標,就是想辦法提升 DNA 修復出錯的機會,提升插入基因序列的效率,使得未來將有缺陷的致病基因能夠被修改以正常的基因取代,藉此治療基因疾病。

(首圖來源:shutterstock) 

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