從傳統細胞培養到替代動物試驗的生醫新技術——仿生細胞晶片

動物實驗是目前新藥開發必經的臨床前驗證過程，是推進人類醫學與生命科學發展的必要之惡。其中，以用於基礎研究的動物數量最多，其次是生物醫學研究、以及針對家庭產品和其他消費品所進行的毒性測試等。同時有許多營利性的公司每年飼養與銷售幾千萬隻的實驗動物，藉以獲取龐大利潤。（本文出自中央大學生醫科學與工程學系許藝瓊副教授，於閎康科技「科技新航道 | 合作專欄」介紹「動物試驗的替代方案？仿生晶片應用於藥物開發」文稿，經科技新報修編為上下兩篇，此篇為上篇。）本網站內容著作權係屬 TechNews 或授權本網站使用之提供者所有，不得作為商業用途形式傳輸、散布或提供予公眾。

面對動物實驗的殘忍議題，一直以來持續引發激烈論戰，科學上越適合當作實驗對象的動物，往往讓實驗在道德面站不住腳。所幸，隨著生物科技的進步，某些特定動物實驗已找到了替代方案，也有許多藥物的安全性已被確認，再加上動保觀念的提升，促使各國近年來紛紛修法減少動物實驗。而全世界對於對待實驗動物，也已有奉行「3R原則」的普遍共識。所謂的 3R 原則指的是替代（Replacement）、減量（Reduction）、與精緻化（Refinement）。然而，欲避免有任何動物再為實驗犧牲，全面開發替代方案才是根本的解決之道。

仿生細胞晶片是一項人類共同亟待的「慈悲」科技。基本上，它是由微流體晶片演化而來的應用技術，其發展融合了物理、化學、生物學、醫學、材料學、工程學和微機電等多個不同學門的專業知識，被譽為是「十大新興技術」之一。仿生晶片通常體積很小，僅需要使用極少量的試劑或樣品，即可達到相同的檢測需求。有別於傳統的 2D 培養，仿生晶片藉由微流體環境控制技術，可模擬出接近真實的人體內部 3D 環境，有效替代或輔助現有之細胞與動物實驗模型，用以測試人體器官對藥物的反應、或進行高通量藥物篩選等。由於其能更精準地分析生物作用機制、並提升藥物測試之正確度，未來將極有機會藉以加速新藥開發，同時大大減少動物試驗數量、並降低臨床試藥的人命風險。本網站內容著作權係屬 TechNews 或授權本網站使用之提供者所有。

2D靜態細胞培養作法

傳統 2D 靜態細胞培養技術是一種平面的培養方式，由於其和體內實際的立體生長環境差別很大，此極易導致細胞的成長結果在形態、分化、細胞與基質間的相互作用、及細胞與細胞間之作用等諸多方面，與真實的體內細胞行為有明顯差異。因此，為了進一步確認該細胞培養結果的正確性，通常還是會需要再進行相關的動物實驗來求證。然而，建立動物模型的代價極高[1]，需要花費漫長時間、昂貴成本，且必須克服潛在的小鼠基因組污染等問題，此也大大限制了 2D 靜態細胞培養作法的可能應用空間。有鑑於此，為了加速生醫領域的研究發展，近幾年學者們紛紛開始尋求更具潛力的替代方案。本網站內容著作權係屬 TechNews 或授權本網站使用之提供者所有。

進行細胞培養時，如何創造出貼近人類體內的環境？

傳統的平面靜態細胞培養方式，大多是使用聚苯乙烯為材料的培養皿來進行。這種作法雖然可以大量地培養出細胞，但難以模擬細胞處於體內生理環境時的真實生長行為。大多數細胞需要來自 3D 環境的線索，才能培養出接近體內的相關生理組織和器官。舉例來說，膠原蛋白和基質膠是用來包覆培養細胞的常見材料，以往在 2D 或準 3D 環境中進行的基質硬度對細胞行為與功能影響之相關研究，皆已獲證實，其結果無法代表體內的真實狀況。近年來，隨著生物科技不斷的演進，帶動了細胞培養技術發展逐漸從 2D 走向 3D，其中以應用仿生細胞晶片作為藥物開發的相關研究，最受到廣泛的關注。本網站內容著作權係屬 TechNews 或授權本網站使用之提供者所有。

仿生細胞晶片主要是透過 3D 的動態培養方式，來模擬接近人體體內條件的組織細胞作用情形。以 3D 方式培養的細胞，可在各個面向真正實現細胞與細胞間接觸，並可透過不同的細胞類型和細胞外基質應用，設計出複雜的組織結構，使其與體內細胞行為及基因表達趨勢相符合，藉以模擬體內例如氧氣和營養輸送的梯度變化等現象。透過 3D 細胞培養作法的輔助，能使藥物篩檢的數據更加正確，也能更精準地預測藥物濃度所帶來的效益及毒性，其具有無限的發展潛力[2]。

逐步發展的研究方法：仿生細胞晶片

利用仿生晶片來建立仿生培養模型，目前已是生物科技領域的熱門研究方向，尤其是近幾年相當熱門的研究主題「器官晶片（Organ-on-a-chip, OOC）」，更得以最大程度地模擬體內環境，為醫學及藥物研發帶來全新的可能。仿生細胞晶片的應用，不僅可作為藥物篩檢平台，在模擬環境下正確篩檢出有用的候選藥物，同時也能夠作為藥物治療評估及藥效作用機轉確認之測試平台，經由基因定序分析及功能性探討藥物影響下的標的訊息傳遞途徑，來建立各種生物標記。

仿生細胞晶片的最初發現與研發過程：模擬肺部環境

所謂「器官晶片」是指在微系統晶片（Microsystem）上，模擬人體內器官運作的情形，此概念最早由美國哈佛大學的 Donald E. Ingber 和 Dan Dongeun Huh 提出[3,4]，他們起初是在一微晶片上成功模擬肺器官之運作（圖 1）。該晶片構造主要藉由一聚二甲基矽氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）薄膜，將中央區域的微流道分為上下兩層。PDMS 是一種高生物相容性、且高彈性的材料，很適合在上面培養細胞。該 PDMS 薄膜表面上開有許多小孔洞，而上下兩端的流道內分別通予空氣和血液，用來模擬氣管和血管。其左右側的流道則是提供適當真空，用以給予該薄膜張力。當施與 PDMS 薄膜高張力時，可模擬肺泡膜的漲縮動作。

▲圖1　仿生肺晶片裝置

圖 1 （A, B）說明該微流體晶片如何模仿肺部環境，其通過對兩側室施加真空引起機械呼吸，來造成類似生理呼吸作用的 PDMS 薄膜拉伸。（C）是將晶片的上下部份與 PDMS 薄膜層粘合在一起。粘合之後如（D）所示，再使用適當蝕刻劑對兩側通道內的 PDMS 膜層進行選擇性蝕刻移除。（E）是完成製作的實際肺微流體晶片外觀[3]，透過此仿生晶片，可真實模擬緊密貼合的人類肺上皮和內皮細胞層組成結構，經由通入空氣和流體流動、及週期性的薄膜機械應變，來模仿肺部組織的正常呼吸運動。目前基於傳統 2D 細胞培養模型的臨床前藥物開發研究，仍需依賴於昂貴且耗時的動物實驗測試。藉由此晶片的通道與薄膜設計來創建模仿人類肺部疾病的測試模型，將有機會省去後續動物模型的驗證需求，快速方便地達到肺泡-毛細血管界面作用的研究目的。本網站內容著作權係屬 TechNews 或授權本網站使用之提供者所有。

仿生細胞晶片之應用和研究進展

目前類似原理的微型仿生細胞培養晶片，已被成功應用在模擬不同的人體器官功能，例如上皮層和內皮層間之多層界面經歷呼吸誘導的循環機械拉伸[5]等相關研究。而對於常用的體外研究模型，例如體外靜態癌細胞培養，仿生晶片技術無論在實驗操作、所需時間、及高通量篩選（High Throughput Screening）等方面，均具有相當大的應用優勢。

近年來仿生晶片的研究進展，已成功篩選出離子通道抑製劑（GSK2193874），用以治療 IL-2 對肺部造成的毒性[6]。期望生醫領域盡快開發出更多整合功能的器官晶片，能夠大幅取代早期活體動物測試，快速便利地觀察細胞或組織的生理改變。同時，也期待研究者未來還能進一步在晶片的細胞內製造相當程度的疾病產生，用以觀察疾病是否因為藥物投入而得到緩解。

在疾病形成機制的應用研究方面，仿生晶片已可使用生物工程方法來控制拉力與流力，並準確評估細胞變化和臨床治療的結果[7]。圖 2 整理了目前可模擬肺癌轉移不同階段的各種相關微流控設備[8]，例如利用通入水凝膠的微流體晶片裝置，經混合膠原的基質膠組合物，來模擬肺細胞於不同的癌症侵襲階段的微環境。其作法是經由形態改變和機械力作用來調整水凝膠晶片狀態條件，再使用定量圖像分析測量 H1299 肺腺癌的癌症細胞在不同的實驗條件下之遷移結果。

▲圖2　用於研究肺癌轉移的各種仿生微流體晶片設計[8]。

由此類仿生晶片研究結果發現，肺腫瘤細胞可從膠原基質中的間充質遷移到接近膠原基質膜，將可應用於高通量藥物篩選研究和治療藥物評估[9]。不僅如此，此類晶片也具模擬生理參數的能力，為動物實驗提供另一種潛在的替代方案，用以預測抗癌藥物的功效及毒性（圖3）[10]。

▲圖3　化學療法（包括 Cisplatin 和 Etoposide）的藥物敏感性。

(a)：顯示在第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）Cisplatin 處理後，在微流體晶片裝置上培養 LCO 的形態變化圖像。
(b)：在 Etoposide 治療後第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）在微流體晶片裝置上培養的肺癌細胞圖像。
(c)：第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）經 Cisplatin 處理後，在塑料粘附的基底膠（Matrigel）小滴中培養肺癌細胞的形態變化圖像。
(d)：第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）依 Etoposide 處理後，在粘附有塑料的 Matrigel 液滴中培養 LCO 的代表性圖像。
(e)：使用微流體晶片裝置在藥物處理 72 小時後通過螢光測量細胞活力。
(f)：在藥物治療後 72 小時通過螢光測量細胞活力[10]。